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課程43

中藥中農(nóng)藥殘留的分析和新技術(shù)的應(yīng)用

1. 農(nóng)藥與農(nóng)藥殘留
農(nóng)藥指用于防治、消滅或者控制危害農(nóng)業(yè)、林業(yè)的病、蟲、草和其他有害生物以及有目的地調(diào)節(jié)植物、昆蟲生長的化學(xué)合成的或者來源于生物、其他天然物質(zhì)的一種物質(zhì)或者幾種物質(zhì)的混合物及其制劑。
農(nóng)藥殘留簡稱為農(nóng)殘，是指農(nóng)藥使用后殘存于生物體、農(nóng)副產(chǎn)品和環(huán)境中的農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱。
中藥是我國寶貴的文化遺產(chǎn)，是中華民族防治疾病、康復(fù)保健、繁衍后代的一大法寶。近年米，世界各國對天然藥物的需求日益擴(kuò)大，尤其對綠色藥品尤為關(guān)注。現(xiàn)在，世界每年中藥貿(mào)易額已達(dá)400億美元，而且每年以10％的速度增長，日前我國中藥出口額約6億美元，僅占世界植物藥材市場的3％～5％，這與我國中藥大國的地位極不相稱。中藥材有效成分的不確定與農(nóng)藥、重金屬等有害物質(zhì)的殘留量超標(biāo)，是中藥躋身世界的兩大障礙。我國出口的中草藥在歐美等國市場上多次因農(nóng)藥殘留超標(biāo)等原因被查扣，農(nóng)藥殘留污染已成為中藥走向世界的障礙，成為當(dāng)前中藥生產(chǎn)中急待解決的重要問題。

2. 農(nóng)藥的種類
農(nóng)藥按主要用途分類：主要有殺蟲劑、殺螨劑、殺鼠劑、殺軟體動物劑、殺菌劑、殺線蟲劑、除草劑、植物生長調(diào)節(jié)劑等。按來源分類：主要有化學(xué)農(nóng)藥、微生物農(nóng)藥和植物性農(nóng)藥三大類。
化學(xué)農(nóng)藥是指化學(xué)合成的農(nóng)藥，包括有機(jī)農(nóng)藥和無機(jī)農(nóng)藥。有機(jī)農(nóng)藥是一類通過人工合成的對有害生物具有殺傷能力和調(diào)節(jié)其生長發(fā)育的有機(jī)化合物，如六六六。人工合成有機(jī)農(nóng)藥有機(jī)氯類、有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類。無機(jī)農(nóng)藥是一類包括天然礦物在內(nèi)可直接用來殺傷有害生物的化合物，如硫磺等。
微生物農(nóng)藥是利用一些對病蟲有毒、有殺傷作用的有益微生物，通過一定的方法培養(yǎng)，加工而成的一類農(nóng)藥，如白僵菌等。
植物性農(nóng)藥是一類以植物為原料加工制成的農(nóng)藥，如煙草、除蟲菊等。
2.1 有機(jī)氯類農(nóng)藥
有機(jī)氯農(nóng)藥可以歸納為兩大類:一類為氯代苯及其衍生物，如BHC、DDT、PCNB等。另一類為氯化甲撐萘制劑，如狄氏劑、艾氏劑等。六六六，英文縮寫B(tài)HC。工業(yè)六六六是白色固體，含有多種成分和立體異構(gòu)體，目前己分出7種異構(gòu)體，其中含量較多的有5種，即α、β、γ、δ、ε體。滴滴涕，英文縮寫DDT。滴滴涕是一種廣譜有機(jī)氯類殺蟲劑，其工業(yè)品為乳白色塊狀固體，是幾種異構(gòu)體與其它脂溶性雜質(zhì)的混合物。滴滴涕的半衰期為2～4年，在土壤中消失95%需4～30年（平均為10年），是高度殘留性的農(nóng)藥。
各種有機(jī)氯農(nóng)藥均具有揮發(fā)性低、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、不易分解、易溶于脂肪和有機(jī)溶劑等性質(zhì)。有機(jī)氯農(nóng)藥屬于神經(jīng)毒物和實(shí)質(zhì)臟器毒物，該類化合物可通過消化道、呼吸道和皮膚吸收，分布到各器官和組織，在血中幾乎全部與血漿蛋白結(jié)合，主要蓄積在脂肪組織，可致癌。因其是一類高效廣譜殺蟲劑，我國20世紀(jì)50～7O年代曾廣泛使用。
由于有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量大，毒性大，污染性強(qiáng)，造成農(nóng)田嚴(yán)重污染。1983年我國停止了有機(jī)氯農(nóng)藥的生產(chǎn)，1984年停止使用。有機(jī)氯類農(nóng)藥較難降解，在環(huán)境中的殘留半衰期為數(shù)年，最長可達(dá)十余年，因此在農(nóng)藥殘留研究中仍受到重視。
2.2 有機(jī)磷類農(nóng)藥
有機(jī)磷農(nóng)藥大多數(shù)品種為磷酸酯類或硫代磷酸酯類化合物，常見有機(jī)磷農(nóng)藥有敵敵畏、樂果、敵百蟲、甲胺磷等，其結(jié)構(gòu)式如下：

中藥材GAP生產(chǎn)中禁止使用的農(nóng)藥種類
                                                                                          
種類　　　　          農(nóng)藥名稱　　　　　　　　　　　　　　               禁用原因
                                                                                          
有機(jī)氯殺蟲劑          滴滴涕、六六六、林丹、艾氏劑、狄氏劑 　　          高殘毒
有機(jī)砷殺蟲劑          甲基砷酸鋅（稻腳青）、甲基砷酸鈣砷（稻高殘毒寧）   高殘毒
                         甲基砷酸鐵銨（田安）、福美甲砷、福美砷
有機(jī)汞殺蟲劑 　       氯化乙基汞（西力生）、醋酸苯汞（賽力散）           劇毒、高殘毒
鹵代烷類熏蒸 　       二溴乙烷、環(huán)氧乙烷、二溴氯丙烷、溴甲烷             致癌、致畸、
阿維菌素　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　                高毒
無機(jī)砷殺蟲劑 　       砷酸鈣、砷酸鉛　　　　　　　　　　　　　           高毒
有機(jī)磷殺蟲劑 　       甲攔磷、乙攔磷、久效磷、對硫磷、甲基對硫磷、       劇毒、高毒
                      甲胺磷、異柳磷、治螟磷、氧化樂果、磷胺、
                      地蟲硫磷、滅克磷（益收寶）、水胺硫磷、氯唑磷、
                      硫線磷、殺撲磷、特丁硫磷、克線丹、苯線磷、
                      甲基硫環(huán)磷
氨基甲酸酯            涕滅威、克百威、滅多威、丁硫克百威                 高毒、劇毒或
殺蟲劑　　　 　       丙硫克百威　　　　　　　　　　　　　　　           代謝物高毒
二甲基甲脒類 　       殺蟲脒　　　　　　　　　　　　　　　  　           慢性毒性、致癌
氟制劑　　　  　      氟化鈣、氟化鈉、氟乙酸鈉、氟鋁酸胺、 　            劇毒、高毒、
　　　　　　 　       氟硅酸鈉　　　　　　　　　　　　　　 　            易產(chǎn)生藥害
有機(jī)氯殺螨劑  　      三氯殺螨醇　　　　　　　　　　　　　　             含滴滴涕
有機(jī)磷殺菌劑 　       稻瘟凈、導(dǎo)師稻瘟凈、（異嗅米）　　　　 　          高毒
                                                                                        

3. 中藥的農(nóng)藥污染途徑
中藥的農(nóng)藥污染途徑有：直接污染、間接污染、加工流通中的污染和食物鏈造成的污染。
3.1 直接污染
中藥材在種植過程中濫用農(nóng)藥，使得大量藥劑直接附著在植株上。由于中藥材的種植者缺乏基本的植保常識，未重視農(nóng)藥殘留問題，濫用農(nóng)藥的現(xiàn)象十分嚴(yán)重。有些藥材的種植者對農(nóng)藥的選擇標(biāo)準(zhǔn)是高效、便宜，很少顧及農(nóng)藥毒性及高殘效對中藥材質(zhì)量的影響。為保產(chǎn)增收，種植者施藥次數(shù)頻繁，且經(jīng)常是幾種高毒農(nóng)藥混配使用，特別是在蟲害嚴(yán)重時(shí)期，使用農(nóng)藥的濃度加倍，不僅殺死了大量病蟲害的天敵，而且使得病蟲抗藥性增加、防治成本和防治難度越來越大，同時(shí)造成了中藥材農(nóng)藥殘留超標(biāo)，加重了農(nóng)藥在藥材產(chǎn)區(qū)周邊環(huán)境中的殘留，給藥材生產(chǎn)帶來了持續(xù)性的危害，形成了難以逆轉(zhuǎn)的惡性循環(huán)，使藥材質(zhì)量越來越差。
3.2 間接污染
中藥材從環(huán)境中被動吸收一些高殘留農(nóng)藥。在中藥材種植和生產(chǎn)過程中，忽視種植環(huán)境對藥材的污染，如：藥材生長周圍環(huán)境土壤、水源、大氣的污染等。雖然高殘留的有機(jī)氯農(nóng)藥六六六、滴滴涕早在70年代就被禁用，但這些農(nóng)藥半衰期長達(dá)60年，容易通過食物鏈在植物體內(nèi)形成生物累積。其他農(nóng)藥如有機(jī)磷、氨基甲酸酯、菊酯類殺蟲劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)中多有不穩(wěn)定的酯鍵，殘效期一般都比較短，因此這幾類農(nóng)藥在中藥材中檢出的殘留量低或殘留情況較少。
3.3 加工流通中的污染
在中藥材采收、加工、保存、運(yùn)輸過程中造成的農(nóng)藥污染也十分嚴(yán)重，如一些中藥材產(chǎn)區(qū)，在施用農(nóng)藥后不久就開始采收；藥材炮制過程中加入的輔料中含有較高的農(nóng)藥殘留；使用包裝、運(yùn)輸過農(nóng)藥的媒介物來包裝、運(yùn)輸中藥材等。
3.4 食物鏈造成的污染
由于環(huán)境和食物鏈被污染和破壞，動物類中藥材可以因食物鏈的蓄積而被污染，就可能威脅人類健康。
4. 中藥農(nóng)藥殘留的監(jiān)控現(xiàn)狀
國際上從1970年起開始研究藥用植物的農(nóng)藥殘留問題，1980年世界衛(wèi)生組織將農(nóng)藥殘留測定單獨(dú)列為檢測項(xiàng)目。自20世紀(jì)80年代初期開始，我國中成藥工業(yè)就開始推行藥品GMP（Good Manufacture Practice）制度，但由于各種原因，作為中成藥生產(chǎn)原料的中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP）認(rèn)證工作進(jìn)展較為緩慢。我國目前現(xiàn)有的各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)參差不齊，有國家藥典標(biāo)準(zhǔn)、部頒標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)。GAP的制定和實(shí)施嚴(yán)重滯后，制約了中成藥產(chǎn)品質(zhì)量的提高，更加嚴(yán)重地阻礙了我國中藥產(chǎn)品的國際競爭力。
中國藥典2000版一部首次對黃芪和甘草制定了限量標(biāo)準(zhǔn)（總BHC不超過千萬分之二，總DDT不超過千萬分之二，PCNB不超過千萬分之一），附錄也首次收載了有機(jī)氯農(nóng)藥測定，標(biāo)志著我國對于藥材農(nóng)藥殘留的研究已進(jìn)一步規(guī)范化，標(biāo)準(zhǔn)化，法制化。2001年7月1日起實(shí)施國家對外貿(mào)易經(jīng)濟(jì)合作部發(fā)布的“藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)”，規(guī)定的限量指標(biāo)總BHC、總DDT和PCNB含量均不得大于0.1mg•kg-1。關(guān)于總BHC、總DDT的標(biāo)準(zhǔn)，“進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)”高于中國藥典2000年版的規(guī)定。
2002年我國頒布“中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP）（試行）”，自2002年6月1日起實(shí)行。為我國中藥材的生產(chǎn)和質(zhì)量管理提供了相應(yīng)的理論依據(jù)和法律規(guī)則。
《中國藥典》2005年版開始對國內(nèi)中藥產(chǎn)品的無公害標(biāo)準(zhǔn)作出強(qiáng)制性規(guī)定，此次規(guī)定的核心內(nèi)容是中藥產(chǎn)品中的重金屬及砷鹽、黃曲霉素、農(nóng)藥殘留及微生物含量必須不超標(biāo)。這一強(qiáng)制規(guī)定使更多的中藥材種植和生產(chǎn)企業(yè)向國際市場邁進(jìn)，以提高我國中藥材出口水平。
5. 中藥農(nóng)藥殘留的檢測方法
我國當(dāng)前的中藥材中農(nóng)藥殘留分析方法研究以氣相或液相色譜配備不同的檢測器為主，較少采用各種色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)；大部分采用傳統(tǒng)的提取、分離手段，被測農(nóng)藥主要集中于有機(jī)氯類農(nóng)藥，其中以六六六、滴滴涕為主，研究仍集中在個(gè)別中藥材品種或某類農(nóng)藥的檢測方法研究，尚沒有中藥材中農(nóng)藥殘留全分析的研究報(bào)道。
隨著人們對食品、環(huán)境安全的日益關(guān)注以及新的、更高要求的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的出臺，農(nóng)藥殘留分析技術(shù)發(fā)展迅速。現(xiàn)代農(nóng)藥殘留分析技術(shù)通常包括樣品前處理和測定兩部分。
5.1 前處理技術(shù)
農(nóng)藥殘留分析前處理是指將殘留農(nóng)藥從樣品中最大限度地提取出來，并消除分析檢測過程中的干擾物，主要包括樣品制備、提取、凈化、濃縮等步驟。
前處理技術(shù)主要液-液萃取、液-固萃取、索氏提取、超聲波提取、微波輔助萃取和加壓液體萃取等。
液-液萃?。簝?yōu)點(diǎn)是萃取分離法設(shè)備簡單；其不足之處是選擇性差，常有大量共提物，需進(jìn)一步分離凈化，溶劑消耗量較大且具有毒性。液-液萃取提取劑的選擇：①農(nóng)藥殘留量測定屬痕量分析，因此對溶劑純度要求較高，應(yīng)盡量選用農(nóng)藥殘留級或者環(huán)境保護(hù)分析專用試劑。②采用相似相溶原理來選擇溶劑，極性小的農(nóng)藥應(yīng)選擇低極性溶劑提取，如六六六、DDT等應(yīng)選用石油醚、正己烷等。③沸點(diǎn)一般要求在45～80℃之間，沸點(diǎn)過低，易揮發(fā)，不易操作;沸點(diǎn)過高，則不易濃縮，并會引起不穩(wěn)定農(nóng)藥的分解。
固相萃取技術(shù)（SPE）：利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再利用洗脫液洗脫或加熱解吸附。用于液相色譜分析農(nóng)藥殘留量的樣品前處理，目的是分離和富集目標(biāo)化合物。分離模式根據(jù)填料的不同，SPE主要有正相SPE、反相SPE和離子交換SPE等類型。優(yōu)點(diǎn)是克服了液液萃取乳化技術(shù)，只需5～1Omin。溶劑量為液-液萃取法的10%，減輕了有機(jī)溶劑對人身和環(huán)境的影響。固相萃取技術(shù)（SPE）操作步驟為：進(jìn)樣前活化處理，上樣，洗滌，洗脫。
5.2 檢測技術(shù)
農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)主要有薄層色譜法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法、酶抑制法、免疫分析法等。
氣相色譜法（GC）：在已報(bào)道的文獻(xiàn)中，對殘留農(nóng)藥的檢測大部分采用GC法。本法適用于易氣化且氣化后不發(fā)生分解的農(nóng)藥，氣相色譜柱以毛細(xì)管柱為主。常用的檢測器：分析有機(jī)氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥采用電子捕獲檢測器（ECD）、分析有機(jī)磷農(nóng)藥采用火焰光度檢測器（FPD）、分析含氮的農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥采用氮磷檢測器（NPD）等。優(yōu)點(diǎn)是分離效果好，選擇性強(qiáng)，靈敏度高。
免疫分析法：是基于抗原、抗體特異性識別和結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法。90年代優(yōu)先研究開發(fā)利用的農(nóng)藥殘留分析技術(shù)，聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）已向許多國家推薦此項(xiàng)技術(shù)，美國化學(xué)會將免疫分析與氣相色譜、液相色譜共同列為農(nóng)藥殘留分析的支柱技術(shù)。由于免疫分析固有的優(yōu)點(diǎn)，它在農(nóng)藥殘留及其它環(huán)境污染物如多聯(lián)苯、二噁英、天然真菌毒素、抗菌素、添加劑等快速篩選和定量檢測方面發(fā)揮著重要作用。免疫分析法分為放射免疫分析（RIA），酶免疫法（EIA），熒光免疫分析（FIA），免疫傳感器，免疫親和色譜法（IAC），流動注射免疫法（FIIA）等方法。
酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）：通過在合適的載體上，酶標(biāo)記的定量抗原與未知抗原競爭固相抗體結(jié)合位點(diǎn)或固相抗原與未知抗原競爭酶標(biāo)記定量抗體的結(jié)合位點(diǎn)，形成復(fù)合物;在底物參與下，復(fù)合物上的酶催化底物使其水解、氧化或還原成帶色物質(zhì)，依靠比色法來確定農(nóng)藥殘留量。ELISA法優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，無需復(fù)雜的檢測設(shè)備，快速簡便，在食品農(nóng)藥殘留的檢測中應(yīng)用較多，檢測水平可達(dá)ng或pg水平。缺點(diǎn)為出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果;且農(nóng)藥不具有免疫原性，必須與載體蛋白質(zhì)連接形成農(nóng)藥-載體蛋白質(zhì)結(jié)合物免疫原，才可用來制備抗體。
生物傳感器法：通常是指由一種生物敏感部件與轉(zhuǎn)換器緊密配合，對特定種類化學(xué)物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可逆性響應(yīng)的分析方法。傳感器的生物敏感層與復(fù)雜樣品中特定的分析物之間(如酶和底物、抗體和抗原、外源凝聚素和核糖核酸與其互補(bǔ)片段間)的識別反應(yīng)會產(chǎn)生一些物理化學(xué)信號（如光、熱、聲、質(zhì)量、顏色、電化學(xué)等）的變化，這種變化通過不同原理的轉(zhuǎn)換器（如光電倍增管、壓電器、光極、熱敏電阻、離子選擇性電極等）轉(zhuǎn)換成第二信號（通常為電信號），經(jīng)放大后顯示或記錄。生物傳感器按照生物功能區(qū)分為酶傳感器、組織傳感器、微生物傳感器等。第三代生物傳感器的主要特征：將生物技術(shù)與微電子技術(shù)相結(jié)合。利用農(nóng)藥對靶標(biāo)酶（如乙酰膽堿酯酶）活性的抑制作用研究酶傳感器，利用農(nóng)藥與特異性抗體相結(jié)合的反應(yīng)特性研制免疫傳感器，可用于對相應(yīng)農(nóng)藥殘留物進(jìn)行快速定性定量檢測。微型化、響應(yīng)速度快的生物傳感器所需樣品量極少，甚至可插入生物組織或細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)超微量在線快速跟蹤分析。主要問題是分析結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差，使用壽命較短。
發(fā)達(dá)國家經(jīng)常采用先進(jìn)的農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)加強(qiáng)農(nóng)藥殘留監(jiān)測工作，所用檢測技術(shù)如氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用以及氣相、液相色譜與多級質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等，這些技術(shù)的應(yīng)用大大提高了農(nóng)藥殘留檢測的定性能力和檢測的靈敏度和檢測覆蓋范圍。目前國外已發(fā)展和建立了可同時(shí)檢測幾百種農(nóng)藥的多殘留分析系統(tǒng)，美國的FDA的多殘留檢測方法可檢測360多種農(nóng)藥、德國DFG方法可檢測325種農(nóng)藥、荷蘭衛(wèi)生部多殘留檢測方法可檢測200種農(nóng)藥、加拿大多殘留檢測方法可檢測251種農(nóng)藥（其中GC-MS檢測239種，HPLC-Fluor檢測12種）。隨著高新分析技術(shù)引入農(nóng)藥殘留檢測之中，農(nóng)藥全分析技術(shù)的應(yīng)用大大提高了檢測的效率和系統(tǒng)性，使得經(jīng)常性的農(nóng)藥殘留全面監(jiān)測成為可能。
6. 展望
有關(guān)農(nóng)藥殘留的檢測方法將進(jìn)一步向多殘留快速測定方向發(fā)展，在檢測方法與國際雙向接軌的基礎(chǔ)上，將開展大面積的中藥中有害殘留物普查，建立基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫，提出合理的限量標(biāo)準(zhǔn)，建立科學(xué)的風(fēng)險(xiǎn)評估和應(yīng)急體系，保障人民用藥安全的同時(shí)打破國際技術(shù)壁壘。另一方面，大力推進(jìn)GAP建設(shè)和環(huán)境改造，從根本上保證中藥質(zhì)量。
積極開展對國際標(biāo)準(zhǔn)的研究工作，參與國際農(nóng)藥殘留的制定。加緊中藥農(nóng)殘的檢測技術(shù)研究，改善設(shè)備，重視國外先進(jìn)檢測方法。加強(qiáng)GAP對中藥材生產(chǎn)實(shí)施規(guī)范化管理，最大限度地保證藥材內(nèi)在質(zhì)量的可行性、穩(wěn)定性，以達(dá)到“安全，有效產(chǎn)量穩(wěn)定、可控”的目的。采取有效措施，減少采收、加工、包裝及貯存過程中的污染。
我國既是中藥材生產(chǎn)大國，也是中醫(yī)藥的最大消費(fèi)市場。隨著世界經(jīng)濟(jì)一體化發(fā)展進(jìn)程的加快，我國的中藥材及中成藥必然要走向國際市場參與競爭。藥品質(zhì)量是影響我國中藥出口的首要因素，而農(nóng)藥殘留污染則是影響藥品質(zhì)量的重要因素。只有嚴(yán)把中藥及制劑的質(zhì)量關(guān)，才能使中藥真正達(dá)到治病救人的目的，才能使中醫(yī)藥事業(yè)更加健康地向前發(fā)展，才能促進(jìn)中藥現(xiàn)代化和國際化，相信我國中藥生產(chǎn)必將進(jìn)入有序良性發(fā)展軌道。

（河南大學(xué)  程鐵峰）