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課程37
生物藥品質量分析概況與發(fā)展趨勢

生物藥品，就是把生物工程技術應用到藥物制造領域，從而獲得生物醫(yī)藥制品。是以微生物、寄生蟲、動物毒素、生物組織為起始材料，采用生物學工藝或分離純化技術、制備并以生物學技術和分析技術控制中間產物和成品質量制成的生物活化制劑，包括菌苗、疫苗、毒素、類毒素、血清、血液制品、免疫制劑、細胞因子、抗原、單克隆抗體及基因工程產品等。目前，生物制藥產品主要包括三大類：基因工程藥物、生物疫苗和生物診斷試劑。其在診斷、預防、控制乃至消滅傳染病中發(fā)揮著越來越重要的作用。生物技術引人醫(yī)藥產業(yè)，使得生物醫(yī)藥業(yè)成為最活躍、進展最快的產業(yè)之一。
藥品是人們用于防病治病，康復保健的特殊物質。藥品的質量好壞直接影響人們的健康和生命。因此藥品質量監(jiān)督檢驗對保障人們用藥安全有效、合理，維護人們的身體健康有著及其重要的意義。生物藥品不同于一般的藥品。一般藥品是用重現(xiàn)性較好的物理和化學技術進行生產和質量控制的。而生物藥品的原輔材料需要種類多質量要求高，生產涉及生物學技術，其生產檢驗的可重復性遠遠低于物理化學的方法。建立規(guī)范的質量控制標準是保證生物藥品質量的重要途徑，本文就疫苗、血液制品等生物藥品的質控現(xiàn)狀做一簡述。
        1. 生物藥品的特點
生物藥品生產涉及到生物學過程和生物材料，如細胞培養(yǎng)或從活的生物體中提取，這些生物過程有其固有易變性。此外，用于這些培養(yǎng)過程的物料又是微生物繁殖的良好基質，例如生物制品中的血液制品生產，從血漿中分離血漿蛋白，粘度大，不易清洗、消毒，又是細菌很好的營養(yǎng)液。所以，生物藥品系生產須無菌而又不能在最后的容器中滅菌的無菌制劑?？偨Y起來生物藥品具有以下特點：
（1）原材料都是活性材料，故對其儲存、加工等有要求；
（2） 生產加工工藝過程是生物學過程；
（3）檢驗和控制質量采取生物學方法(有變異性）；
（4）生產過程中保持無菌，最后也不能滅菌，所以全過程需要執(zhí)行GMP。
        2. 各類生物藥品的質控現(xiàn)狀、問題及解決方法
2.1疫苗
2.1.1疫苗的質控現(xiàn)狀
疫苗是將病原微生物（如細菌、病毒、立克次氏體等）及其代謝產物，經(jīng)過人工減毒、培養(yǎng)、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預防傳染病的生物藥品。疫苗的預防接種不但保護個體免受傳染病病原體的侵襲，而且在群體中限制了病原微生物的傳播。疫苗的發(fā)明與使用，是人類文明的偉大成就。
相比成分單一的化學藥品而言，疫苗一般為成分復雜的多組分制品，我國生物藥品國家標準中對疫苗質量標準的要求不僅包括成品檢驗項目和指標的規(guī)定，還包括對原輔材料和生產全過程的質量控制。2010年《中國藥典》對疫苗質控的主要內容在于：（1）安全性檢測項目：包括無菌檢查、熱原檢查、毒性試驗、異常毒性試驗、殘留試劑等。（2）有效性檢查，包括：病毒滴度、效價、抗原含量測定等；（3）雜質檢查，包括：卵清蛋白、vero細胞殘余DNA、細胞基質殘留蛋白質、白喉原液抗原純度等，除此之外，對于其輔料如鋁佐劑，防腐劑硫柳汞、苯酚等，都應進行相應的檢查。
由新型病毒或細菌引起的突發(fā)疾病應運而生的新型疫苗，應第一時間建立起疫苗質控標準和評價方法研究，建立疫苗標準品，規(guī)范質控標準和評價方法。毛群穎[1]等根據(jù)創(chuàng)新型疫苗研發(fā)的要求，充分發(fā)揮技術優(yōu)勢，開展EV71疫苗質控標準、標準品和評價方法研究。建立了EV71滅活疫苗的中和抗體和抗原定量測定標準品，統(tǒng)一不同企業(yè)疫苗的質控標準，規(guī)范疫苗的評價體系，為EV71疫苗的研發(fā)提供保障。
2.1.2存在的問題及解決方法
相比國外對疫苗的技術監(jiān)管，我國在1951年才產生第一部生物藥品技術法規(guī)，兩者之間相差了50年。在我國政府和疫苗制造行業(yè)的共同努力下，尤其是經(jīng)過近20年的快速發(fā)展，我國疫苗質量標準與國外的差距已大大縮小，但仍在很多方面存在差距，如雜質的檢查和輔料檢查等，這就要求我們必須做到：（1）完善疫苗質量標準的思考；（2）進一步加強對生產起始材料的控制，完善生產工藝。進一步加強對生產用菌毒種、生產用細胞的管理和控制，從源頭上保證疫苗質量的安全、有效和穩(wěn)定，開展毒種基因穩(wěn)定性研究，以及生產用細胞鑒別試驗的研究。進一步加強動物來源的原、輔材料的質量控制，開展凍干疫苗中明膠賦形劑的替代研究，提升疫苗的安全性；（3）完善檢測方法。提高檢測方法的準確性和可靠性，完善標準物質的建立；完善相關檢測方法的適用性再驗證工作；積極開展新方法研究，特別是涉及疫苗安全性指標的檢測以及效價測定方法的研究和應用，進 一步提高檢測方法的靈敏度和準確性。
近些年來，國內涌現(xiàn)出了許多控制疫苗質量的新技術和新方法，馬慶華等[2]針對b型流感嗜血桿菌多糖蛋白結合疫苗生產工藝中經(jīng)常使用的四種化學物質(CNBr、CDAP、EDAC和ADH)進行了檢測方法的研究和開發(fā)。應用包括液相、液質聯(lián)用、離子色譜等儀器設備，開發(fā)出上述四種物質的檢測方法，再運用方法學手段進行了有效的驗證，不僅可以用來有效監(jiān)測多糖蛋白結合疫苗生產過程中殘余物質的水平，還可以為企業(yè)所進行的生產工藝的驗證提供可靠的數(shù)據(jù)保障。
2.2血液制品
2.2.1血液制品質控現(xiàn)狀
血液制品是在臨床輸血的基礎上發(fā)展起來，它通過將血漿中的有效組分分離出來并用于治療。血液制品是重要的生物藥品，在醫(yī)療急救及某些特定疾病的預防和治療上血液制品有著其他藥品和生物藥品不可替代的臨床療效，目前血液制品包括各種人血漿蛋白制品，包括人血白蛋白、免疫丙種球蛋白、凝血因子類、特殊因子類等。對血液制品的控制主要在于以下幾方面：（1）血漿復檢測：主要包括體檢、傳染性指標檢測；（2）血漿檢疫期管理；（3）原輔料檢測；（4）生產條件和環(huán)境監(jiān)測；（5）生產工藝控制：乙醇、層析等純化；（6）病毒滅活工藝考察等。
2.2.2 存在的問題及解決辦法
血液質量缺陷主要表現(xiàn)為:脂肪血、凝塊血、溶血、纖維蛋白析出等[3]。其成因與許多環(huán)節(jié)的不規(guī)范操作有關，如血液采集與成分制備環(huán)節(jié)；血液儲存、發(fā)放與運輸環(huán)節(jié)；血液制品臨床使用環(huán)節(jié)等。因此，對于血液樣品的控制主要集中在提高血液采集質量，細化成分制備流程、建立并完善一整套用于血液制品儲存和運輸?shù)睦滏溝到y(tǒng)、加強醫(yī)療機構用血管理，重視輸血科規(guī)范化建設，確保臨床用血安全等方面。
2.3單克隆抗體
2.3.1單克隆抗體的質控現(xiàn)狀
1975 年德國科學家 Kohler 和英國科學家 Mil－stein 利用雜交瘤技術將產生抗體的B淋巴細胞同骨髓瘤細胞融合，成功的建立了單克隆抗體制備技術，單克隆抗體技術是現(xiàn)代生命科學研究的重要工具，其在基因和蛋白質的結構與功能研究方面有著不可或缺的作用，在人類和動植物的免疫學診斷方面至今仍有著無可代替的重要作用[4]。由于單克隆抗體可能含有用傳統(tǒng)生產方法不存在的有害物質，所以這類產品的質量控制與傳統(tǒng)方法生產的產品有本質的差別，其質量控制更具復雜性和多樣性，除需要鑒定最終產品外，還需對培養(yǎng)、純化等每個生產環(huán)節(jié)嚴格控制，才能保證最終產品的有效性、安全性和一致性。
目前單克隆抗體的質控主要包括以下幾個方面：（1）檢查抗體分泌穩(wěn)定性：連續(xù)克隆化后抗體陽性率達100%，經(jīng)體外連續(xù)傳代3個月以上和反復凍存、復蘇，細胞系能保持穩(wěn)定分泌特異性抗體；（1）觀察細胞核學特征：檢查細胞分裂中期染色體，應符合雜交瘤細胞特征；（3）鼠源病毒檢查，支原體檢查及無菌實驗；（4）單克隆抗體檢定；（5）免疫球蛋白類及亞型測定：用免疫雙擴散法或其他適宜的方法測定；（6）單克隆抗體親和力測定：用可靠、準確的方法測定單克隆抗體（以下簡稱為單抗）的親和常數(shù)或相對親和力。一般情況下，對于免疫原為可溶性的單抗，測其親和常數(shù)，對于免疫原為顆粒性抗原的單抗，測其相對親和力。（7）特異性檢查：測定單抗對靶抗原的特異性；對多株單抗識別的抗原決定簇進行相關性分析。交叉反應：免疫組織化學法測定單抗與人體組織交叉反應，用冰凍及石蠟包埋的各種正常臟器組織測定。來源于瘤相關抗原的單抗應進行與各種腫瘤組織的交叉反應試驗；（8）效價測定。（9）熱原檢查；（10）異常毒性試驗  （11）外觀及PH值；（12）蛋白質含量測定：用Lowry法或其它適宜的方法測定。（13）純度測定：用電泳法、HPLC法、多聚體測定法等進行測定；（14）DNA含量測定；（15）水分檢查（16）雜質檢查：單克隆抗體生產過程中產生的雜質包括宿主細胞中的DNA、蛋白、及其純化過程使用的親和色譜蛋白 A ( ProteinA) 的浸出液。通過生產過程中的控制，應將這些雜質減小到規(guī)定限度之下，因為殘余雜質可能影響產品的生物學活性和藥理作用，還可能具有毒性。因此，單克隆抗體藥物中相關的雜質檢查是單克隆抗體類藥物質控工作的關鍵。雜質檢查主要包括：外源性 DNA 檢查、宿主細胞蛋白( HCP) 檢查、蛋白A檢查。
2.3.2質量控制中分析方法應用
隨著生產工藝及分析手段的進步，單克隆抗體類藥物質量控制將更加嚴格。在下游純化過程到產品鑒定過程、及批檢驗過程都需確證其純度及完整性，并且沒有不需要的修飾發(fā)生。
2.3.2.1基于電荷大小不同而分離抗體的電泳技術
治療用蛋白類藥物的分析在傳統(tǒng)意義上的平板 IEF 的基礎上有了較大的發(fā)展。毛細管等電聚焦電泳( CIEF) 作為一種特殊的微分離技術，在蛋白質、抗體、臨床樣品等生命活性物質的分離分析方面已得到越來越廣泛的應用。與平板凝膠電泳相比，其具有耗時短、樣品用量少、易于自動優(yōu)化等特點，但其分離過程中的活化步驟容易造成已制定的 pH 梯度變化，造成譜帶增寬。而毛細管等電聚焦成像電泳( iCIEF) 則省去了這一步驟，提高了分辨率，重現(xiàn)性好，減少了分析時間，使得樣品處理量增加到 2 倍以上[5]
2.3.2.2基于分子質量大小不同而分離抗體的電泳技術
使用毛細管電泳( CE) 則可縮短樣品分析時間，并提供相同的純度和分子大小信息。最近幾年，以 CE 為核心技術、以芯片為操作平臺的芯片 CE 技術迅速崛起，并成為芯片實驗室( Lab-On-Chip) 的主流技術。但是，這項技術對于雜質的檢測限為 0.5% ～1.0%，比平板凝膠低 5 倍左右。因此，平板凝膠仍不失為一種較好的純化方式。
2.3.2.3高效液相色譜( HPLC) 技術
HPLC應用于抗體鑒定、純化及完整性分析現(xiàn)有很多 HPLC 技術用于單克隆抗體測定，例如離子交換 HPLC、反相 HPLC( RP-HPLC) 和分子排阻色譜，已用于單克隆抗體質量檢定的不同方面。如：單克隆抗體亞型檢查、肽圖檢查、多聚體檢測等。
2.3.2.4流式細胞術
流式細胞術 (FCM) 是20世紀70年代發(fā)展起來的高科技方法，它集計算機技術、激光技術、流體力學、細胞化學和細胞免疫學于一體，同時具有分析和分選細胞功能。流式細胞術是一種快速、準確、客觀，能夠同時檢測單個細胞的多項特性并加以定量的技術，已廣泛應用于生物學、免疫學、藥物學、腫瘤學、血液學、臨床檢驗等方面。流式細胞術的最顯著特點是可在單個細胞水平對大量細胞進行多參數(shù)檢測，從而成為T細胞表型分析及功能評價的最佳技術。孫可芳[6]等采用多參數(shù)的流式細胞分析技術，對單色、多色熒光標記抗體的偶聯(lián)率及偶聯(lián)效果進行分析與評價，并進行穩(wěn)定性試驗。用純化的小鼠抗人19與熒光染料FIT C(異硫氰酸熒光素 ) 或PE(藻紅蛋白)進行標記，通過適當配伍，制備出單色或雙色標記抗體。為使其標記的熒光抗體質量穩(wěn)定可靠，對標記的單色及多色熒光抗體在熒光強度、標記效率 以及穩(wěn)定性等方面進行了檢測，并與國外同類產品進行比較，建立了一套完善的質量控制體系。
2.4動物源性免疫血清制品
2.4.1動物源性免疫血清制品的質控現(xiàn)狀
動物源性免疫血清是用特異性抗原（如毒素、類毒素、菌體或病毒等）對動物進行超免，將血漿經(jīng)胃酶消化和提純制成的被動免疫制劑，用于某些特定疾病或中毒的治療和預防。其種類包括抗毒素和抗血清，兩者間無明確界限，一般而言，前者多以細菌毒素或類毒素作為免疫原，如破傷風抗毒素，后者則多以其它類型抗原作為免疫原，如抗蛇毒血清。從我國 1951 年發(fā)布的第一部相關法規(guī)“生物藥品法規(guī)草案”起至今，抗血清制品的國家標準已歷經(jīng)多次修訂和提高[7]。2010 年版中國藥典的實施，對抗血清制品的質量控制提出了新的要求。
2.4.2血清制品的制備過程的問題及解決方法
2.4.2.1工藝老化，過敏反應率高
由于抗血清為馬源性制劑，對人體而言是異種蛋白，因此必然存在發(fā)生過敏反應的可能性。盡管抗血清的質量較從前已有較大提高，但過敏反應問題一直不容忽視，并已成為限制其應用的最大問題。現(xiàn)階段我國的抗血清制品大多生產工藝陳舊，產品價格低廉，企業(yè)利潤低，缺乏工藝改進的動力。但只有對生產工藝進行升級改進，進一步提高產品純度和比活性，降低蛋白總量，才能從根本上降低過敏反應的風險。
2.4.2.2免疫原的質量控制過于簡單
血清生產的基本原料是馬血漿，馬匹的免疫效果對抗血清的生產至關重要。要提高馬匹的免疫效果，除優(yōu)化免疫程序外，免疫原的質量也是非常關鍵的。然而，我國目前對免疫原的質量控制，只是在藥典通則的“免疫血清生產用馬匹檢疫和免疫規(guī)程”中有籠統(tǒng)的規(guī)定，缺乏細化標準。質量標準缺乏參考依據(jù)，且一般藥品企業(yè)無法自行生產，因此難以保證免疫原質量的穩(wěn)定性。
2.4.2.3病毒安全性
抗血清源于動物血漿，存在病毒感染的可能性，WHO 建議，可選擇適當?shù)闹甘静《竞头椒?，對現(xiàn)有抗血清生產工藝的病毒滅活、去除能力進行驗證[8]
2.5含活菌生物制劑
2.5.1含活菌生物制劑的質控現(xiàn)狀
近幾年來隨著科學的發(fā)展，國內外對微生物的開發(fā)利用有了新的突破，除食品外，藥品中的生物制劑亦有大幅度的增加，尤其是含活菌的生物制劑一擁而出，如何保證含活菌生物藥品的質量是我們面臨的一個重要任務。
2.5.2活菌生物藥品質量標準中存在的主要問題及解決方法
目前活菌生物藥品質量標準仍存在許多問題，如（1）有效菌與污染菌混雜；（2）鑒別試驗以細菌共有的化學成分進行定性，沒有專一性;（3）多菌株同一條件進行檢驗。不是科學地按加入每種菌的生物學性狀進行分別鑒定，如需氧菌、厭氧菌、微氧菌在同一條件下進行分離培養(yǎng)、鑒定，立論不足。
以上問題說明目前含活菌生物藥品的質量標準不夠科學、合理，依其所做的鑒別檢驗，專屬性不強，不能真實反映藥品的質量[9]，因此，通過合理制定活菌生物藥品的質量標準，應充分地了解藥品中所含各種菌的生物學性狀，如培養(yǎng)特點、形態(tài)與染色、生化反應，與本屬其他菌的鑒別要點等。在此基礎上，對制劑進行鑒別實驗、顯微檢查、生化試驗、含量測定、衛(wèi)生學檢查，制定標準時，應充分考慮加入菌的存活期，同時還要考慮貯存條件[10]。根據(jù)細菌存活期制定貯存期，否則生產的藥品放置一段時間后很難達到標準規(guī)定。只有制定合理的、科學的質量標準，才能有效控制藥品的質量，保障人民用藥安全有效。
3對生物藥品質量的展望
經(jīng)過幾十年的努力，我國的生物藥品行業(yè)已經(jīng)具備了相當?shù)纳a規(guī)模,生物藥品的質量控制也逐漸向國際水平接軌。從總體上來講，國內在生物藥品質量控制標準方面基本上與國外一致,某些項目甚至比國外標準還要嚴格，但整個質量控制體系同時也明顯存在著技術儲備相對不足、檢測設備型號陳舊、創(chuàng)新手段不多等問題。因此要使生物藥品逐步接近所謂“絕對安全可靠”必須依靠科學嚴格的綜合保證體系來實現(xiàn)。
3.1 國家管理部門的強制管理
國家成立專門的管理機制,制定相關法律法規(guī)和政策，對采供血事業(yè)行使極為嚴格的監(jiān)督管理。目前我國涉及生物樣品行業(yè)的法律法規(guī)主要包括：《中華人民共和國藥品管理法》、現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》(2010年版)、《藥品生產質量管理規(guī)范》、《生物制品批簽發(fā)管理辦法》、等，為血液制品生產的整個過程提供了法律依據(jù)和技術標準,為保證血液制品的安全提供了嚴格的監(jiān)督和管理的標準。
3.2生產企業(yè)嚴格執(zhí)行技術標準
現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》是我國監(jiān)督管理藥品質量的法定技術標準。血液制品生產企業(yè)必須按照GMP組織生產。GMP是藥品生產質量管理規(guī)范,它對生產各環(huán)節(jié)的管理以及軟硬件都提出了具體要求和規(guī)定,保證制藥過程的規(guī)范性,穩(wěn)定性以及保證制品安全有效具有重要意義。
3.3檢測技術的創(chuàng)新
生物藥品的質量控制涉及多種學科的理論和技術方法，包括生物化學、免疫學、分析化學、生物學、微生物學、病毒學、血液學和蛋白質學等,質量檢定方法多為經(jīng)典的常規(guī)方法,這已經(jīng)成為新型生物藥品研制快速發(fā)展的制約,建立以高技術支持的與國際接軌的生物藥品質量控制體系以成為必然。隨著分析技術的發(fā)展，對產品進行質量控制也趨于自動化和微型化，實時快速地對產品進行分析測定，人們已經(jīng)部分實現(xiàn)了生物藥品的自動化，并為醫(yī)藥、臨床病理等蛋白質化學領域的研究提供了強有力的手段。但即便如此，生物藥品分析仍然是充滿挑戰(zhàn)的復雜過程。
《中國藥典》對于生物藥品質量控制起著主導作用，但也是最低質量標準要求，由于生物藥品的特殊性，其終產品的質量需要嚴格的原材料保證和生產過程的控制，單純依靠終產品檢驗控制產品質量是不夠的。因此，保證生物藥品質量需要依賴嚴格執(zhí)行GMP，按照批準的、經(jīng)過驗證的生產工藝和質量標準進行生產，把好原輔材料質量關等綜合舉措。

參考文獻
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（河南中醫(yī)學院  馮素香）